傳統(tǒng)大曲質(zhì)量評估依賴“感官經(jīng)驗(yàn)+理化指標(biāo)”（如酸度、酶活），缺乏微生物代謝活性評價(jià)；高通量測序雖能解析群落結(jié)構(gòu)，卻難以關(guān)聯(lián)微生物的實(shí)際功能；平板計(jì)數(shù)、熒光染色等傳統(tǒng)活性檢測方法又受限于“可培養(yǎng)性差、耗時(shí)久、指標(biāo)不穩(wěn)定”等問題。因此，開發(fā)一種原位、無損、精準(zhǔn)的高溫大曲微生物代謝活性評估技術(shù)，成為突破白酒釀造質(zhì)量控制瓶頸的關(guān)鍵需求。

(1)樣品預(yù)處理：大曲參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測定總酸與酶活等指標(biāo)，再取1 g大曲樣品與PBS緩沖液勻漿，經(jīng)Nicodenz密度梯度離心（4℃、14000 g、90 min）分離微生物，反復(fù)清洗后獲得純凈微生物懸液；

(2)氘同位素標(biāo)記：將微生物懸液與50%（V/V）D?O共孵育，設(shè)置0、6、12、24、48、72 h共6個(gè)時(shí)間梯度，通過監(jiān)測C-D鍵生成評估代謝活性；

(3)單細(xì)胞拉曼檢測：采用長光辰英P300共聚焦拉曼光譜儀（激發(fā)功率3 mW，采集時(shí)間5 s）獲取單細(xì)胞拉曼光譜，對光譜進(jìn)行去宇宙射線、基線校正與歸一化處理，排除低信噪比（SNR）光譜以保證數(shù)據(jù)質(zhì)量；

(4)數(shù)據(jù)分析與模型構(gòu)建：通過Kruskal-Wallis檢驗(yàn)確定最優(yōu)孵育時(shí)間，基于C/D比（C-D峰面積/(C-D+C-H峰面積)）分類代謝模式；結(jié)合LDA降維、PLS分析篩選特征峰，并通過線性相關(guān)、Spearman相關(guān)分析建立拉曼表型（C/D比、特征峰強(qiáng)度）與大曲物化性質(zhì)的關(guān)聯(lián)；最終以ResNet50為框架構(gòu)建2D-CNN模型，實(shí)現(xiàn)大曲微生物代謝活性型的快速判別。

圖1：高溫大曲微生物代謝活性研究實(shí)驗(yàn)流程示意圖

3.1 確定最優(yōu)D?O孵育時(shí)間：48h

圖2：D?O孵育時(shí)間對高溫大曲微生物拉曼光譜的影響；

A：不同孵育時(shí)間的平均拉曼光譜，灰色陰影標(biāo)注C-D與C-H區(qū)域；B：C/D比隨孵育時(shí)間的變化趨勢

3.2 高溫大曲微生物代謝模式分為三類

基于48 h孵育后的單細(xì)胞C/D比中位數(shù)，18個(gè)大曲樣品被明確分為三類微生物代謝活性型（圖3A）：

lPA-Daqu（高活性型）：C/D比>70%（median=79.91%），微生物代謝能力最強(qiáng)；

lPB-Daqu（中活性型）：C/D比45%-70%（median=58.46%），微生物代謝活性中等；

lPC-Daqu（低活性型）：C/D比<45%（median=40.01%），微生物代謝活性最弱；

三類樣品的C/D比差異極顯著。進(jìn)一步通過LDA降維分析，發(fā)現(xiàn)前兩個(gè)判別軸可解釋57.07%和42.93%的差異，三類微生物代謝活性型大曲在低維空間聚類可明顯區(qū)分（圖 3B）；其中低活性微生物（淺色）因光譜特征相似聚集于中心區(qū)域，高、中活性微生物則呈分散且獨(dú)立的聚類分布。這些結(jié)果揭示了復(fù)雜高溫大曲微生物群中，微生物代謝活性存在顯著分化且呈現(xiàn)明顯的聚類特征，為后續(xù)解析代謝活性與大曲功能的關(guān)聯(lián)奠定了基礎(chǔ)。

圖3：18個(gè)高溫大曲樣品的微生物活性評估；

A：基于C/D比的分類結(jié)果，不同顏色代表不同代謝活性；B：單細(xì)胞拉曼光譜的LDA分析，不同符號(hào)代表不同代謝活性型

3.3 PLS分析識(shí)別22個(gè)代謝關(guān)聯(lián)拉曼特征峰

通過偏最小二乘（PLS）分析，從拉曼指紋區(qū)（500-1800 cm^-1）篩選出22個(gè)與微生物代謝活性顯著相關(guān)的特征峰（VIP>1），并明確其化學(xué)歸屬（圖4A）：

· 蛋白質(zhì)相關(guān)峰：658 cm^-1、1248 cm^-1（酰胺III）、1594 cm^-1（苯丙氨酸C-C）等；

· 脂質(zhì)相關(guān)峰：788 cm^-1、1740 cm^-1（酯類C=O伸縮）等；

· 核酸相關(guān)峰：764 cm^-1（嘧啶環(huán)）、916 cm^-1等；

· 碳水化合物相關(guān)峰：542 cm^-1（糖苷鍵COC）、1028 cm^-1等。

對比顯示：PC-Daqu的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、碳水化合物特征峰強(qiáng)度均顯著低于PA-Daqu與PB-Daqu（圖4B），其中PA-Daqu的1594 cm^-1（蛋白質(zhì)）、764 cm^-1（核酸）峰強(qiáng)度顯著高于PB-Daqu，表明這些生化組分的差異是大曲代謝活性分化的關(guān)鍵因素。

圖4：不同微生物代謝活性高溫大曲的拉曼特征峰PLS分析結(jié)果；

A：采用PLS模型區(qū)分不同微生物代謝活性高溫大曲微生物拉曼光譜圖譜的載荷圖，縱軸VIP值表示對應(yīng)光譜峰對PLS模型的貢獻(xiàn)度；B：比較不同微生物代謝活性高溫大曲的拉曼峰強(qiáng)度

3.4 拉曼表型與理化性質(zhì)顯著關(guān)聯(lián)

線性回歸分析顯示，表征微生物代謝活性的C/D比與高溫大曲總酸度（R2=0.42，P=0.004）、液化酶活性（R2=0.25，P=0.036）、糖化酶活性（R2=0.33，P=0.013）均呈顯著相關(guān)性（圖5A），提示微生物代謝活性與大曲核心理化功能直接相關(guān)；Spearman相關(guān)性分析進(jìn)一步顯示，拉曼特征峰強(qiáng)度與多項(xiàng)理化指標(biāo)顯著相關(guān)（P<0.05，圖 5B），其中542 cm^-1（碳水化合物相關(guān)峰）、884 cm^-1（蛋白質(zhì)相關(guān)峰）強(qiáng)度與總酸度、中性蛋白酶活性、纖維素酶活性呈正相關(guān)，1740 cm^-1（酯類C=O伸縮峰）可反映有機(jī)酸濃度變化，1650-1680 cm^-1（酰胺I 帶）與蛋白質(zhì)合成（酶活前體生成）密切相關(guān)。

上述分析成功建立體外理化表型與拉曼表型的對應(yīng)關(guān)系，在高溫大曲發(fā)酵的低pH環(huán)境下，拉曼光譜可實(shí)現(xiàn)大曲微生物表型活性及代謝動(dòng)態(tài)的實(shí)時(shí)、無損分析，為快速解析微生物的功能適應(yīng)提供有效技術(shù)途徑。

圖5：高溫大曲微生物代謝活性與理化性質(zhì)的相關(guān)性分析；

（A）高溫大曲不同微生物代謝活性下，理化指標(biāo)與C/D比值間的線性回歸分析；（B）微生物理化指標(biāo)與特征峰強(qiáng)度的Spearman相關(guān)性分析

3.5 2D-CNN模型實(shí)現(xiàn)99%準(zhǔn)確率的代謝模式判別

基于22個(gè)拉曼特征峰構(gòu)建ResNet50-2D-CNN模型，以150個(gè)拉曼矩陣（每個(gè)矩陣含300個(gè)單細(xì)胞光譜）為訓(xùn)練集（70%）、測試集（20%）、驗(yàn)證集（10%）。模型訓(xùn)練結(jié)果顯示：迭代100次后，訓(xùn)練集與驗(yàn)證集的損失值降至0，準(zhǔn)確率達(dá) 99%（圖6A）；混淆矩陣表明，模型對PA、PB、PC三類大曲的預(yù)測類別與實(shí)際類別完全匹配（圖6B），可實(shí)現(xiàn)未知大曲樣品代謝模式的快速、精準(zhǔn)判別。

圖 6：用于識(shí)別具有不同微生物代謝活性的高溫大曲微生物單細(xì)胞拉曼光譜的二維卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（2D-CNN）分類模型構(gòu)建；

（A）高溫大曲微生物代謝活性分類的2D-CNN工作流程；（B）2D-CNN模型在100輪訓(xùn)練中的損失值與準(zhǔn)確率變化；（C）驗(yàn)證集的混淆矩陣，用于展示2D-CNN模型的分類性能

(1)確定48 h為大曲D?O孵育的最優(yōu)時(shí)間，可通過C/D比準(zhǔn)確量化微生物代謝活性；

(2)將18個(gè)高溫大曲樣品分為高（PA）、中（PB）、低（PC）三類代謝活性型，三類樣品的C/D比與拉曼特征峰強(qiáng)度差異顯著；

(3)篩選出22個(gè)與代謝活性相關(guān)的拉曼特征峰，涵蓋蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸、碳水化合物等關(guān)鍵生化組分，揭示了代謝活性型分化的分子基礎(chǔ)；

(4)建立了拉曼表型與理化表型的關(guān)聯(lián)（C/D比、特征峰強(qiáng)度與總酸度、液化酶/糖化酶活性顯著相關(guān)）；

(5)構(gòu)建的2D-CNN模型以99%準(zhǔn)確率實(shí)現(xiàn)代謝模式判別，為高溫大曲質(zhì)量快速分級(jí)與白酒釀造過程控制提供了全新技術(shù)方案。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c03199

憑借硬件穩(wěn)定性與軟件智能化的協(xié)同優(yōu)勢，P300不僅助力科研工作者開展高通量、無損的微生物功能解析，也為白酒釀造等產(chǎn)業(yè)質(zhì)量控制提供了前所未有的工具支持。

陸震鳴教授

江南大學(xué)生物工程學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師，現(xiàn)任糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心副主任。主要從事釀造微生物生態(tài)學(xué)研究。受聘為中國調(diào)味品協(xié)會(huì)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)委員、團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)工作委員會(huì)副主任委員，中國食品工業(yè)協(xié)會(huì)全國調(diào)味品專家委員會(huì)委員，國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心工程技術(shù)委員會(huì)委員，四川省固態(tài)釀造技術(shù)創(chuàng)新中心專家委員會(huì)委員，釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室學(xué)術(shù)委員會(huì)委員；《中國調(diào)味品》雜志青年編委。獲“全國科技系統(tǒng)抗擊新冠肺炎疫情先進(jìn)個(gè)人”稱號(hào)。

許正宏教授

四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師，四川大學(xué)先進(jìn)釀造科技創(chuàng)新中心主任。主要從事工業(yè)微生物資源開發(fā)及應(yīng)用研究。受聘為國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心副主任、中國微生物學(xué)會(huì)釀造分會(huì)理事、分子微生物學(xué)專業(yè)委員會(huì)委員，中國調(diào)味品協(xié)會(huì)感官評價(jià)專業(yè)委員會(huì)主任委員、科學(xué)技術(shù)委員會(huì)副主任委員、標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)副主任委員等；擔(dān)任《Food Microbiology》、《Systems Microbiology and Biomanufacturing》等期刊編委。

李備研究員

中國科學(xué)院長春光機(jī)所光學(xué)系統(tǒng)先進(jìn)制造全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員，工業(yè)與信息化部產(chǎn)業(yè)發(fā)展項(xiàng)目專家，博導(dǎo)，生物光子學(xué)科帶頭人。獲得國家海外人才計(jì)劃，人社部國家高層次留學(xué)人才回國資助項(xiàng)目，吉林省長白山特聘領(lǐng)軍人才，吉林省拔尖創(chuàng)新人才人員（一層次），吉林省國家級(jí)領(lǐng)軍人才(B類)；2017年底歸國后創(chuàng)立長春長光辰英生物科學(xué)儀器有限公司（長光辰英），帶領(lǐng)科研創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室X-Lab，與牛津大學(xué)、格拉斯哥大學(xué)、卡迪夫大學(xué)等國際頂尖光學(xué)及微流控等領(lǐng)域科學(xué)家合作，專注于細(xì)胞操縱、拉曼光譜、共聚焦成像、微流控和人工智能五大核心領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)室目前擁有近20位碩博士科研團(tuán)隊(duì)，發(fā)表SCI論文20余篇，承擔(dān)國家及省部級(jí)研發(fā)項(xiàng)目10余項(xiàng)，展現(xiàn)出強(qiáng)大的研發(fā)和創(chuàng)新能力。