《ACS Sens.》丨“激光誘導(dǎo)+微陣列芯片”高活性單細(xì)胞分選新技術(shù)的深度解密

2025.09.19

2025年1月，中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光機(jī)所李備研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所馮世倫教授、香港理工大學(xué)Luo Wei 教授、香港城市大學(xué) Lip Ket Chin 教授在《ACS Sensors》（2025, 10, 846?856）合作發(fā)表題為《Automated Laser-Assisted Single-Cell Sorting for Cell Functional and RNA Sequencing》的研究論文，王云桐博士為第一作者。該文章詳細(xì)介紹了基于激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移（LIFT）技術(shù)與微陣列芯片的高效自動(dòng)化單細(xì)胞分選技術(shù)，該技術(shù)具有高細(xì)胞活率、高分選精度且能精準(zhǔn)識(shí)別稀有細(xì)胞的特點(diǎn)，為解析細(xì)胞異質(zhì)性、推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療研究提供了關(guān)鍵工具。其中，長(zhǎng)光辰英核心產(chǎn)品PRECI SCS可視化單細(xì)胞分選儀結(jié)合HoneyArray微陣列芯片構(gòu)成活體單細(xì)胞分選平臺(tái)，而S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)則承擔(dān)了實(shí)驗(yàn)中高效熒光成像工作。

研究背景

單細(xì)胞分析是解析細(xì)胞異質(zhì)性、探索生命活動(dòng)機(jī)制的核心手段，在腫瘤研究、精準(zhǔn)醫(yī)療等領(lǐng)域至關(guān)重要。然而，傳統(tǒng)單細(xì)胞分選技術(shù)存在諸多局限：手動(dòng)顯微操作效率極低，難以滿足高通量需求；流式細(xì)胞術(shù)雖通量高，但機(jī)械應(yīng)力易降低細(xì)胞活率；微流控技術(shù)則面臨易堵塞、下游培養(yǎng)困難等問題。這些挑戰(zhàn)導(dǎo)致單細(xì)胞分選的效率、精準(zhǔn)度與細(xì)胞活性難以兼顧，制約了下游轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分析的可靠性。因此，開發(fā)一種兼具高通量、高精準(zhǔn)度和高細(xì)胞活率的自動(dòng)化分選技術(shù)成為當(dāng)務(wù)之急。

研究方法

該研究整合激光誘導(dǎo)正向轉(zhuǎn)移（LIFT）技術(shù)與微陣列芯片，構(gòu)建了自動(dòng)化單細(xì)胞分選系統(tǒng)，核心流程如下：

1）芯片制備：微陣列芯片由金屬涂層玻璃基底與微孔膜組成，含超過12萬個(gè)六邊形微孔（直徑25 μm），通過等離子體處理調(diào)控膜表面親疏水性，利用表面張力形成單細(xì)胞皮升液滴；

2）目標(biāo)識(shí)別：基于自研光學(xué)顯微系統(tǒng)（含熒光成像模塊），通過明場(chǎng)或熒光信號(hào)識(shí)別異質(zhì)細(xì)胞群中的目標(biāo)細(xì)胞；

3）激光分選：采用脈沖激光（350 nJ）聚焦于目標(biāo)細(xì)胞所在微孔，通過LIFT機(jī)制產(chǎn)生液流，將單細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板；

4）下游驗(yàn)證：對(duì)分選細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq），驗(yàn)證細(xì)胞活性與轉(zhuǎn)錄組完整性。

圖1 自動(dòng)化激光輔助單細(xì)胞分選系統(tǒng)用于單細(xì)胞培養(yǎng)和RNA測(cè)序的流程概述。

結(jié)果

3.1 設(shè)計(jì)與工作原理驗(yàn)證

該系統(tǒng)核心為微孔陣列芯片與LIFT技術(shù)結(jié)合的設(shè)計(jì)：微孔陣列膜（10 mm×10 mm）包含超過12萬個(gè)六邊形微孔，孔徑（25 μm）與單細(xì)胞尺寸（10-20 μm）匹配，通過重力（G）、毛細(xì)力（Fcf）、附著力（Faf）與表面張力（Fst）的協(xié)同作用，使細(xì)胞懸液快速形成單細(xì)胞皮升液滴。分選時(shí)，脈沖激光聚焦于目標(biāo)細(xì)胞所在微孔，通過金屬膜瞬時(shí)汽化產(chǎn)生空化泡，驅(qū)動(dòng)液滴噴射至96孔板，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化精準(zhǔn)分選。

圖2. 激光輔助單細(xì)胞分選儀的示意圖及工作原理。

(a) 微陣列芯片，包含用于單細(xì)胞分離的微孔膜。(b) 制備的微孔膜顯微照片。比例尺為 20 μm。(c) 示意圖展示細(xì)胞液滴沉積到微孔陣列芯片上的初始狀態(tài)和最終狀態(tài)，最終實(shí)現(xiàn)每個(gè)微孔內(nèi)的單細(xì)胞分離。(d) 細(xì)胞液滴的受力分析。(e) 基于激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移（LIFT）的目標(biāo)細(xì)胞分選過程中單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞釋放操作的示意圖。

3.2 單細(xì)胞分離與分選效率

分離效率：當(dāng)PC-9（人肺腺癌細(xì)胞系）細(xì)胞濃度為5×10?-5×10?cells/mL時(shí)，單細(xì)胞分離效率穩(wěn)定在80%以上，共聚焦成像證實(shí)細(xì)胞被精準(zhǔn)限制在微孔內(nèi)；

分選參數(shù)優(yōu)化：激光能量350nJ時(shí)，分選效率達(dá)100%，細(xì)胞存活率79.2%±4.2%，且分選后細(xì)胞可連續(xù)培養(yǎng)15天；

溫度安全性：有限元模擬顯示，激光作用產(chǎn)生的熱量?jī)H在3μm范圍內(nèi)擴(kuò)散，細(xì)胞所在區(qū)域溫度<37°C，無熱損傷風(fēng)險(xiǎn)。

圖3. 單細(xì)胞分離。

(a)單個(gè)PC-9細(xì)胞在不同微孔中分離的圖像，標(biāo)注了每個(gè)細(xì)胞的直徑。(b)單個(gè)PC-9細(xì)胞在微孔中被分離的共聚焦圖像。(c)不同細(xì)胞濃度下的單細(xì)胞分離效率。(d)不同激光能量下單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞的分選效率。(e)激光輔助單細(xì)胞分選系統(tǒng)分選后，單個(gè)PC-9細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)顯微圖像。

3.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分選與培養(yǎng)

在轉(zhuǎn)染率1%-5%的PC-9細(xì)胞群中，該分選系統(tǒng)通過熒光信號(hào)識(shí)別GFP標(biāo)記的CLIC4過表達(dá)細(xì)胞，激光分選后成功培養(yǎng)至第8天，熒光活性保持穩(wěn)定。整個(gè)過程無交叉污染，細(xì)胞損失率極低，驗(yàn)證了稀有細(xì)胞分選的可靠性。

圖4.轉(zhuǎn)染細(xì)胞分選。

(a)待分選目標(biāo)細(xì)胞的明場(chǎng)圖像、(b)熒光圖像及(c)激光疊加圖像。接收孔的熒光圖像（d）分選前和（e）分選后。(f)目標(biāo)細(xì)胞分選后蓋玻片的明場(chǎng)圖像。(g)熒光顯微圖像展示通過激光輔助單細(xì)胞分選儀分選后，單個(gè)目標(biāo)細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)狀態(tài)。

3.4 單細(xì)胞RNA測(cè)序

本研究選擇最溫和的單細(xì)胞分選方法——口吸法作為對(duì)照，評(píng)估新方法對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響。結(jié)果顯示，該技術(shù)分選細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)與對(duì)照高度一致：總比對(duì)率均超91%，外顯子reads占比、基因表達(dá)分布及檢出基因數(shù)無顯著差異，即使激光能量提升至800nJ，轉(zhuǎn)錄組完整性仍穩(wěn)定。

圖5.單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)Ρ取?/span>

(a)使用手動(dòng)顯微操作技術(shù)（對(duì)照組）、激光輔助單細(xì)胞分選儀在最佳能量350nJ（最佳組）及更高能量800nJ（雙倍能量組）條件下，RNA測(cè)序獲得的總比對(duì)reads數(shù)占參考基因組reads數(shù)的百分比。(b)根據(jù)比對(duì)結(jié)果計(jì)算的比對(duì)到外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)和基因間區(qū)的reads占比。(c)所有基因表達(dá)的分布圖。(d)基因數(shù)量的分布圖。

此外，表1系統(tǒng)對(duì)比了該技術(shù)與FACS、液滴微流控等主流方法，在分選精度、細(xì)胞損傷等關(guān)鍵指標(biāo)上的優(yōu)勢(shì)更清晰可見。

表1.單細(xì)胞分選技術(shù)的對(duì)比分析

結(jié)論

該研究開發(fā)的可視化單細(xì)胞分選技術(shù)實(shí)現(xiàn)了三大突破：①單細(xì)胞分離準(zhǔn)確率≈100%，兼容5×10?-5×10?cells/mL 濃度范圍；②細(xì)胞存活率＞80%，滿足下游培養(yǎng)需求；③支持高質(zhì)量 scRNA-seq，且操作簡(jiǎn)便（一鍵分選），克服了傳統(tǒng)方法的低效率、高損傷等局限。該技術(shù)為單細(xì)胞多組學(xué)分析、稀有細(xì)胞（如循環(huán)腫瘤細(xì)胞）篩選及精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究提供了可靠工具，有望推動(dòng)單細(xì)胞功能與多組學(xué)研究。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acssensors.4c02417

辰英價(jià)值

長(zhǎng)光辰英的PRECI SCS可視化單細(xì)胞分選儀是本研究的核心工具，其整合的納秒級(jí)激光系統(tǒng)與高精度XY位移臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了100%的分選精準(zhǔn)度與80%的細(xì)胞存活率，為自動(dòng)化分選提供了硬件保障；配套的微陣列芯片通過12萬級(jí)微孔設(shè)計(jì)與精準(zhǔn)親疏水調(diào)控，支撐了活體單細(xì)胞分離效率，滿足高通量實(shí)驗(yàn)需求。

同時(shí)，S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)憑借其高分辨、高掃描速度等特點(diǎn)，完成了本研究中細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證及分選后細(xì)胞狀態(tài)監(jiān)測(cè)等細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。長(zhǎng)光辰英“分選-成像”解決方案，為單細(xì)胞研究提供了高效、可靠的實(shí)驗(yàn)工具，助力科研人員突破技術(shù)瓶頸，探索細(xì)胞異質(zhì)性的奧秘。

《ACS Sens.》丨“激光誘導(dǎo)+微陣列芯片”高活性單細(xì)胞分選新技術(shù)的深度解密

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