2025年2月14日，中國科學院廣州地球化學研究所李繼兵、羅春玲老師團隊在《Environmental Science & Technology》期刊發表了題為“Single-Cell Analysis of Microbial Degradation Mechanisms and Remediation Potential for Emerging Pollutants: A Case Study on Methylnaphthalene”的論文。文章通過穩定同位素-拉曼活細胞分選（RACS-SIP）技術和基因測序技術，首次在石油污染廢水中原位鑒定了兩株2-甲基萘（MP）高效降解功能微生物——鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）和假單胞菌（Pseudomonas sp.），并揭示了其差異化的代謝途徑，為環境中新污染物的生物修復提供了重要的理論依據和技術支撐。長光辰英核心產品——PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀為MP降解菌的篩選與分離提供了關鍵技術支撐。

一、研究背景

烷基多環芳烴（PAH衍生物）是一類新興環境污染物，其烷基取代結構降低了水溶性，導致生物累積性和毒性增強，對生態系統和人類健康構成嚴重威脅。微生物降解是消除這類污染物的核心途徑，但傳統培養技術難以原位分離功能微生物，且環境微生物存在分離和培養困難，無法深入探究其代謝機制和群落互作機制。

穩定同位素探針（SIP）技術作為一種無需分離培養的功能微生物群落篩選技術，配合PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀能夠原位識別和分離環境功能微生物，結合單細胞基因檢測技術，能夠深入探究功能微生物的代謝機制，實現原位探查環境多環芳烴衍生物降解菌并對污染物的降解途徑進行深入了解。

二、研究方法

本研究采用2-甲基萘（MP）為模型PAH，分別采用¹²C和¹³C標記的MP作為底物添加到石油污染廢水中，經PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀對環境微生物進行拉曼光譜采集后，通過特征峰的位移識別¹³C標記的MP活性降解微生物。同時，對兩種MP孵育的廢水微生物群落進行16s擴增子測序判斷群落結構差異。接著，對兩組微生物群落的總DNA進行提取，進行DNA-SIP實驗，計算對應基因的相對富集因子（Relative Enrichment Factor，REF）以判斷特定基因對MP降解的參與程度。對分選到的MP活性降解菌進行全基因組擴增后測序，探究MP代謝通路與功能基因。最后，將分離培養的原位降解菌與已有的高效MP降解菌進行降解效率評估，強調真實環境中原位污染物降解微生物的重要性。

圖1 SIP-RACS實驗流程與分選培養菌降解效率評估示意圖

三、結果

1. 拉曼光譜揭示13C標記MP活性降解菌

¹³C標記的MP與廢水共孵育4天后，¹³C-MP處理組中功能微生物細胞在968 cm^-1和768 cm^-1處出現顯著拉曼光譜峰位移，而¹²C-MP組無此現象（圖2 a）。其中，¹³C-MP標記的細胞中968 cm^-1峰位由¹²C-MP中1001 cm^-1位置紅移得到，而768 cm^-1峰位由782/784 cm^-1位置紅移得到。對各峰位的拉曼光譜峰強進行統計，¹³C標記細胞的968 cm^-1和768 cm^-1峰強度顯著高于¹²C-MP組（p < 0.001），驗證了同位素標記的有效性（圖2 b）。  

圖2 活性MP降解菌SIP標記后在污染廢水中的拉曼光譜檢測

圖a為¹²C-MP和¹³C-MP原位孵育后的細胞單細胞拉曼光譜，分別標記為¹²C-cell和¹³C-cell。t = 0天的光譜表示¹³C-MP在時間0天時處理的細胞。每個光譜是來自40個細胞的SCRS的平均值。圖b為¹³C-MP活性細胞、¹³C-MP未標記細胞和¹²C-MP細胞分別在768、781、967和1001 cm^?1處的拉曼光譜峰強統計

2. MP活性降解微生物鑒定

將上述RACS-SIP分析得到的¹³C-MP標記活性微生物單細胞進行分離和單細胞基因組擴增（圖3 a），對分離的40個單細胞基因組進行16S rRNA擴增子測序分析，確定了兩種對MP降解至關重要的微生物：鞘氨單胞菌（Sphingomonas sp.）和假單胞菌（Pseudomonas sp.），這兩株菌的16s rRNA基因與Sphingomonas echinoides strain 14與Pseudomonas simiae PICF7的相似度分別達到99.9%和98.5%（圖3 b）。  

圖3 MP活性降解菌的單細胞分離與鑒定

圖a為分選芯片上MP降解活性微生物細胞的鑒定（左）與分離（右）；圖b為基于16S rRNA基因序列鑒定¹³C標記的活性MP降解菌的微生物系統發育樹

通過DNA-SIP驗證上述鑒定的兩株MP活性代謝菌在降解¹³C-MP中的作用，結果發現Sphingomonas sp.（ASV_27）與Pseudomonas sp.（ASV_97）在¹³C標記的重DNA中的REF值分別為12.0和60.1，相對豐度分別為0.91%和7.89%，顯著富集，因此，將Sphingomonas sp.與Pseudomonas sp.確認為原位MP降解功能菌（圖4 ab）。  

圖4 DNA-SIP實驗中兩種MP活性降解菌的REF比較與功能基因豐度差異

圖a為SIP識別活性降解菌在DNA-SIP實驗中的相對富集因子(REF)；圖b為培養4天后¹³C-MP環境中鞘氨單胞菌和假單胞菌的相對豐度變化，T0為未孵育的原廢水樣品；圖c和圖d為¹²C-MP和¹³C-MP微環境中提取的DNA中nfd (c)和nah (d)基因豐度與浮力密度（BD, g/mL）的相關性，其中“輕”和“重”的DNA片段被高亮顯示

3. MP降解菌代謝途徑解析與分離培養

對RACS-SIP分離的降解菌進行基因測序與分析，在Sphingomonas sp.中注釋到了萘雙加氧酶基因nah1和nah2，在Pseudomonas sp.中注釋到了nah3和3 -萘甲醛脫氫酶nfd。這表明Sphingomonas sp.菌株具有將芳香環羥基化的MP降解能力，而Pseudomonas sp.則可通過芳環羥基化和甲基末端氧化雙通路來降解MP（圖5 a）。

從RACS-SIP分選的細胞中成功培養了一株命名為Sphingomonas sp. LJ（下稱LJ）的目標菌株，通過16S rRNA基因測序證實其與RACS分選的Sphingomonas sp.具有100%的相似性。

 圖5 2株MP活性代謝菌的代謝通路示意圖與分離培養菌代謝效率評估

圖a為¹³C-MP標記分選細胞的MP代謝途徑重建示意圖；圖b為分選培養菌株LJ與傳統MP降解菌GIG1、GIG2分別在MM培養基和廢水中MP的生物降解效率評估

為了評估原位功能微生物的污染物降解效果，采用傳統方法分離出高效MP降解菌GIG1和GIG2。將這兩株菌和和RACS-SIP分選出的菌株LJ分別在MM培養基與原始廢水中進行降解效果評估。結果顯示，傳統菌株GIG1和GIG2的降解率（88.1%和80.2%）在MM培養基中顯著高于原位菌株LJ（63.4%），但在實際廢水環境中LJ的降解率顯著提升（87.1%），而GIG1/GIG2無顯著差異（65.5–66.3%）。該結果表明，通過穩定同位素探針標記技術（RACS-SIP）篩選獲得的環境原位功能微生物，在實際環境條件下展現出顯著的多環芳烴（MP）降解優勢。這一發現不僅證實了原位功能微生物在復雜環境體系中的高效降解能力，更凸顯了特定環境條件下本土微生物群落對污染物生物修復的關鍵作用。該研究成果為開發基于原位微生物強化的環境修復技術提供了重要的科學依據和實踐指導。

四、結論

本研究創新性地采用單細胞拉曼分選-穩定同位素標記聯用技術，首次在單細胞分辨率水平上揭示了石油污染廢水中多環芳烴衍生物的微生物降解網絡。Sphingomonas sp.和Pseudomonas sp.通過互補的差異化代謝途徑形成協同降解體系，顯著提升了廢水中甲基化多環芳烴的降解效率。特別值得注意的是，經RACS技術分選培養的Sphingomonas sp. LJ功能菌株在實際環境條件下展現出卓越的降解性能，這一發現不僅驗證了原位功能微生物在環境修復中的獨特優勢，更為多環芳烴衍生物等新興污染物的生物修復策略制定和原位監測技術開發提供了重要的理論依據和技術支撐。

原文鏈接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.4c14757

五、辰英價值

本研究借助長光辰英自主研發的PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀，運用RACS-SIP技術，成功實現了對石油污染廢水中¹³C標記的活性MP污染物降解菌的精準識別與無損分離。該儀器集成了拉曼光譜檢測與基于激光誘導向前轉移（LIFT）原理的單細胞分選系統，為探究MP降解菌的功能基因與代謝通路開辟了新途徑。其搭載的HOOKE IntP軟件，具備批量處理及同位素偏移峰分析功能，為¹³C引發的拉曼光譜峰位移分析提供了有力支持。綜上所述，PRECI SCS-R300拉曼單細胞分選儀為復雜環境中功能微生物的精準鑒定提供了新策略，為環境新興污染物的生物修復策略奠定了堅實技術基礎。

六、團隊介紹

李繼兵

中國科學院廣州地球化學研究所副研究員，碩士生導師。2018年于中國科學院大學獲博士學位。曾獲廣東省杰出青年基金、廣州市科技菁英“領航”計劃。入選中國科學院廣州分院年度優秀青年科技工作者、“中國科學院青年創新促進會”會員、“廣東省100位博士博士后創新人物”和“國家博士后創新人才支持計劃”，獲得中國科學院優秀博士學位論文和中國科學院院長優秀獎等。主要從事環境微生物技術和土壤有機污染，尤其是發展和利用穩定同位素示蹤（SIP）-單細胞拉曼分選和分子生物學聯用技術，開展多環芳烴/石油烴及其衍生物等有機污染物的生物降解研究。相關成果發表SCI論文50余篇，第一/通訊作者SCI論文31篇，包括ISME J、Environmental Science & Technology、Water Research、Soil Biology and Biochemistry、Environmental Microbiology、Applied and Environmental Microbiology等國際權威期刊論文，授權國內國際發明專利15件。現任國際期刊《Resources, Environment and Sustainability》及《地球化學》青年編委。

羅春玲

博士，研究員。2006年，于香港理工大學獲博士學位。學科方向為環境有機地球化學。近期研究主要集中在有機污染物在土壤-植物系統的遷移轉化、土壤生物修復、污泥資源化利用。研究成果發表SCI刊物論文150余篇，論文被SCI引用5000余次，參與編寫論著3部，授權發明專利10余項。現任中國土壤學會土壤環境專業委員會委員、中國土壤學會國際合作專業委員會委員、中國環境科學學會新污染物治理專業委員會委員、廣東省可持續發展協會理事。曾入選中國科學院國外杰出人才引進計劃“百人計劃”（2010）、中組部“萬人計劃”青年拔尖人才（2017）、獲國家優秀青年基金（2014）資助。