2025年1月27日，北京大學(xué)集成電路學(xué)院王瑋教授團(tuán)隊(duì)與大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院王琪教授團(tuán)隊(duì)、中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光機(jī)所李備研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在《Advanced Science》上合作發(fā)表了題為“High-Viability Circulating Tumor Cells Sorting From Whole Blood at Single Cell Level Using Laser-Induced Forward Transfer-Assisted Microfiltration”的文章，第一作者為許清梅博士與王云桐博士。文中提出了一種全血中單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells, CTCs）無標(biāo)簽富集與回收方法，將激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移技術(shù)（Laser-induced forward transfer, LIFT）與雙層微濾器（Double-stepped microfilter, DSMF）相結(jié)合，在單細(xì)胞水平上構(gòu)建了集成CTC富集與分選系統(tǒng)（Laser-induced forward transfer-assisted microfiltration system, LIFT-AMFS）。長(zhǎng)光辰英核心產(chǎn)品——PRECI SCS-F熒光單細(xì)胞分選儀作為L(zhǎng)IFT-AMFS中的單細(xì)胞可視化精準(zhǔn)分選平臺(tái)，助力DSMF富集，為CTCs的高活性分選與收集提供了有力工具。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是腫瘤轉(zhuǎn)移檢測(cè)和個(gè)性化醫(yī)療的重要生物標(biāo)志物。然而，傳統(tǒng)的CTC分析方法（如計(jì)數(shù)或染色）在分子水平上的表征能力有限。單細(xì)胞分選技術(shù)作為促進(jìn)個(gè)性化腫瘤學(xué)發(fā)展，探究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的新工具，在近年來取得了顯著進(jìn)展，包括熒光激活細(xì)胞分選、磁激活細(xì)胞分選以及基于微孔或微滴的方法。然而，這些技術(shù)不適用于處理稀有細(xì)胞或少量細(xì)胞樣本。因此，開發(fā)一種能夠從全血中高效分選并獲取高活性CTC單細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)顯得尤為重要。

本研究開發(fā)了一種激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移-微濾系統(tǒng)（LIFT-AMFS），用于從全血中高效回收高活性的單個(gè)CTC。研究主要開發(fā)制造了LIFT兼容的雙層微濾器（DSMF），它由兩層微孔組成：下層較小的微孔用于基于細(xì)胞大小的非目標(biāo)細(xì)胞分離，上層較大的微孔則用于捕獲單細(xì)胞液滴。采用人肺癌細(xì)胞添加至PBS或健康人全血中，模擬腫瘤患者全血中的CTCs。通過CTC回收率和活性檢測(cè)驗(yàn)證了DSMF的富集效果，并結(jié)合PRECI SCS-F熒光單細(xì)胞分選儀實(shí)現(xiàn)全血中高活性CTC單細(xì)胞回收，利用單細(xì)胞RNA-Seq（Single cell RNA sequencing, scRNA-Seq）和單細(xì)胞離體培養(yǎng)驗(yàn)證了LIFT-AMFS的回收單個(gè)CTC的活性及有效性，系統(tǒng)工作原理流程如圖1所示。

圖1 LIFT-AMFS 進(jìn)行單 CTC 富集和分選的原理概述

圖a為稀有腫瘤細(xì)胞添加到全血中制備模擬樣品流程；圖b為使用DSMF富集CTC，并進(jìn)行染色鑒定CTC的流程；圖c為基于LIFT技術(shù)定位和回收目標(biāo)CTC；圖d為回收細(xì)胞在細(xì)胞接收器內(nèi)體外培養(yǎng)和增殖；圖e為回收細(xì)胞的RNA提取與處理，以進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析

DSMF分為上下兩層，濾孔呈密排六邊形，上層微孔孔徑大于下層微孔孔徑，下層微孔基于細(xì)胞尺寸分離CTC細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)CTC富集；上層用于封裝CTC液體層，減少表面張力的同時(shí)，保持細(xì)胞活性（圖2 a）。

將稀有腫瘤細(xì)胞分別添加至PBS與健康人全血中驗(yàn)證DSMF的富集回收率與通量，結(jié)果表明，在不同尺寸的DSMF設(shè)計(jì)中，CTCs在PBS和全血中的捕獲效率分別為80.1%~87.4%和76.2%~88.3%（圖2 b），處理通量最高可達(dá)15.0 mL/min。

對(duì)DSMF富集后的細(xì)胞活性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，DSMF捕獲的CTC細(xì)胞活性為81.3 ± 6.5%（圖2 e）。將DSMF捕獲的細(xì)胞進(jìn)行原位培養(yǎng)，隨著時(shí)間推移，分離細(xì)胞表現(xiàn)出良好的粘附和增殖能力（圖2 f），進(jìn)一步證實(shí)了DSMF的生物相容性。

圖2 DSMF富集效果驗(yàn)證

圖a為DSMF富集CTC原理圖；圖b為DSMF微濾器在全血樣品中捕獲腫瘤細(xì)胞的效率(淺藍(lán)色條)和白細(xì)胞殘留數(shù)量(深藍(lán)色條)；圖c為不同細(xì)胞濃度下的細(xì)胞捕獲效率；圖d為DSMF的樣品處理效率；圖e為DSMF富集前后腫瘤細(xì)胞的活性；圖f為捕獲的腫瘤細(xì)胞在微濾器上的原位培養(yǎng)顯微照片

2. 單個(gè)CTC的精準(zhǔn)分選回收

圖3 LIFT-AMFS系統(tǒng)單細(xì)胞分選流程及熒光顯微圖像

圖a為明場(chǎng)和熒光下微孔中CTC細(xì)胞的鑒定和定位；圖b為PRECI SCS-F熒光單細(xì)胞分選儀的脈沖激光將細(xì)胞推出微孔的過程；圖c為細(xì)胞接收器中成功接收單個(gè)CTC的示意圖與顯微圖像

為確定LIFT分選后的CTC活性，并驗(yàn)證LIFT-AMFS系統(tǒng)回收單細(xì)胞用于下游分子分析的可行性（圖4 a），對(duì)分選得到的CTC分別進(jìn)行了離體培養(yǎng)與scRNA-Seq。結(jié)果表明，回收的CTC保持了高活性（圖4 b）和基因組完整性。回收CTC的cDNA產(chǎn)量超過4.5 ng（圖4 c），scRNA-Seq的Q30得分均高于95.92%，且生物重復(fù)之間呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)性（圖4 d, e），表明了分選回收細(xì)胞的可靠性和一致性。

圖4 LIFT-AMFS回收細(xì)胞活性與下游scRNA-Seq分析結(jié)果

圖a為通過LIFT-AMFS回收單個(gè)CTC后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)和scRNA-Seq的總體工作流程；圖b為L(zhǎng)IFT-AMFS回收第0天、第3天和第5天的腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)增殖結(jié)果；圖c為分選單個(gè)CTC逆轉(zhuǎn)錄的cDNA含量；圖d為L(zhǎng)IFT-AMFS (LAMFX, X = 1,2,3,4,5)和顯微操作系統(tǒng)(MMX, X = 1,2,3,4,5)處理的CTC單細(xì)胞樣品間的scRNA-Seq相關(guān)性熱圖；圖e為L(zhǎng)IFT-AMFS和顯微操作系統(tǒng)scRNA-Seq得到的差異基因聚類表達(dá)熱圖

本研究成功開發(fā)并驗(yàn)證了LIFT-AMFS系統(tǒng)用于從全血中無標(biāo)記、快速地富集和精準(zhǔn)分選高活性CTC。該系統(tǒng)在CTC富集階段的捕獲效率高達(dá)88%，最高處理通量達(dá)到15.0 mL/min，分選階段的單細(xì)胞得率超過95%。與現(xiàn)有其他單細(xì)胞分選平臺(tái)相比，LIFT-AMFS系統(tǒng)在無標(biāo)記富集、細(xì)胞活性保持和單細(xì)胞分選精度方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，為腫瘤生物學(xué)研究提供了有力的工具。

原文鏈接：

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202414195

本研究中構(gòu)建了LIFT-AMFS高活性CTC富集分選平臺(tái)，采用了長(zhǎng)光辰英自主研發(fā)的PRECI SCS-F熒光單細(xì)胞分選儀作為細(xì)胞富集后的單細(xì)胞分離系統(tǒng)。該儀器不僅可以在顯微物鏡下直觀識(shí)別多重?zé)晒馊旧腃TC，并且能夠基于LIFT原理實(shí)現(xiàn)單個(gè)CTC的精準(zhǔn)、無損分離，保障了回收CTC的活力。下游單細(xì)胞培養(yǎng)與scRNA-Seq結(jié)果均表明PRECI SCS-F具有細(xì)胞高活性分選的能力。除本文中的CTC分選外，長(zhǎng)光辰英還推出了Honey Array微陣列分選培養(yǎng)芯片，可實(shí)現(xiàn)液體中微生物單細(xì)胞的高活性分選。

另外，本研究中驗(yàn)證DSMF富集后CTC細(xì)胞活性的熒光染色成像采用了長(zhǎng)光辰英的S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)，該儀器采用LED面光源激發(fā)，降低了光毒性，同時(shí)，轉(zhuǎn)盤式共聚焦技術(shù)極大提高了成像速度，在本文高效驗(yàn)證了DSMF富集后CTC的活性。

北京大學(xué)博雅特聘教授，博導(dǎo)，教育部長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授，國(guó)家卓青，微米/納米加工技術(shù)國(guó)家級(jí)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)學(xué)術(shù)帶頭人。長(zhǎng)期從事微系統(tǒng)相關(guān)技術(shù)研究，主持國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等多項(xiàng)國(guó)家級(jí)項(xiàng)目，在Lab Chip、IEEE MEMS、ECTC等領(lǐng)域重要期刊和會(huì)議上發(fā)表學(xué)術(shù)論文190余篇，授權(quán)發(fā)明專利40余項(xiàng)（美國(guó)專利2項(xiàng)）。擔(dān)任微米納米加工技術(shù)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，中國(guó)微米納米技術(shù)學(xué)會(huì)副秘書長(zhǎng)，中國(guó)儀器儀表學(xué)會(huì)微納器件與系統(tǒng)技術(shù)分會(huì)、中國(guó)機(jī)械工程學(xué)會(huì)微納制造技術(shù)分會(huì)、中國(guó)微米納米技術(shù)學(xué)會(huì)微納流控技術(shù)分會(huì)和微納米制造及裝備分會(huì)等學(xué)會(huì)理事，國(guó)家集成電路標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)委員、特種元器件標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)委員（微系統(tǒng)專項(xiàng)組組長(zhǎng)），《Microfluidics and Nanofluidics》副主編、《Microsystems & Nanoengineering》編輯等社會(huì)和學(xué)術(shù)職務(wù)。

王琪，大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科二級(jí)教授，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，博導(dǎo)，呼吸學(xué)科帶頭人、肺癌中心主任。先后被評(píng)為國(guó)家衛(wèi)生健康突出貢獻(xiàn)中青年專家、國(guó)務(wù)院特殊津貼專家、遼寧省先進(jìn)工作者、遼寧省特聘教授等多項(xiàng)榮譽(yù)個(gè)人。現(xiàn)任中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)呼吸分會(huì)常務(wù)委員、中華醫(yī)學(xué)會(huì)內(nèi)科分會(huì)委員、中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)肺癌學(xué)組委員等，并兼任The clinical respiratory journal 副主編、《中華結(jié)核與呼吸雜志》和《中國(guó)肺癌雜志》編委。主要研究方向?yàn)椤盎谖⒘骺匦酒夹g(shù)的肺癌基礎(chǔ)與臨床研究”。主持“國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目”、“國(guó)家自然科學(xué)基金重大科研儀器項(xiàng)目、重點(diǎn)項(xiàng)目及面上項(xiàng)目”等國(guó)家級(jí)課題8項(xiàng)；以第一完成人身份獲遼寧省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、教育部科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、華夏醫(yī)學(xué)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)等多項(xiàng)獎(jiǎng)項(xiàng)；主編及參編著作4部，發(fā)表論文100余篇，包括The Lancet Digital Health、Advanced Material、Journal of Thoracic Oncology 等雜志；獲國(guó)家發(fā)明專利6項(xiàng)。

中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光機(jī)所光學(xué)系統(tǒng)先進(jìn)制造全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員，工業(yè)與信息化部產(chǎn)業(yè)發(fā)展項(xiàng)目專家，博導(dǎo)，生物光子學(xué)科帶頭人。獲得國(guó)家海外人才計(jì)劃，人社部國(guó)家高層次留學(xué)人才回國(guó)資助項(xiàng)目，吉林省長(zhǎng)白山特聘領(lǐng)軍人才，吉林省拔尖創(chuàng)新人才人員（一層次），吉林省國(guó)家級(jí)領(lǐng)軍人才(B類)；2017年底歸國(guó)后創(chuàng)立長(zhǎng)春長(zhǎng)光辰英生物科學(xué)儀器有限公司（長(zhǎng)光辰英），帶領(lǐng)科研創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室X-Lab，與牛津大學(xué)、格拉斯哥大學(xué)、卡迪夫大學(xué)等國(guó)際頂尖光學(xué)及微流控等領(lǐng)域科學(xué)家合作，專注于細(xì)胞操縱、拉曼光譜、共聚焦成像、微流控和人工智能五大核心領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)室目前擁有近20位碩博士科研團(tuán)隊(duì)，發(fā)表SCI論文20余篇，承擔(dān)國(guó)家及省部級(jí)研發(fā)項(xiàng)目10余項(xiàng)，展現(xiàn)出強(qiáng)大的研發(fā)和創(chuàng)新能力。