2024年10月2日，東北林業(yè)大學焦驕教授團隊在《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》期刊發(fā)表了題為“Enhanced Accumulation of Health-Promoting Cajaninstilbene Acid in Pigeon Pea Hairy Root Cultures Cocultured with an Endophytic Fungus during Early Stages of Colonization”的文章。文章通過共培養(yǎng)揭示了木豆內生真菌（Penicillium rubens，P. rubens）促進其毛狀根中木豆芪酸（Cajaninstilbene acid, CSA）生物合成與積累的機制。長光辰英核心產(chǎn)品——S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)為P. rubens定殖木豆毛狀根過程的可視化提供了快速、直觀的檢測手段。   

一、研究背景

豆類是全球主要的人類使用糧食作物之一，其中木豆以富含各種營養(yǎng)成分和生物活性化合物受到消費者的高度青睞。在木豆的多種生物活性化合物中，CSA是天然的芪類化合物之一，該化合物在抗氧化、抗菌和抗腫瘤等領域具有良好的開發(fā)潛力。然而CSA在木豆中合成和積累受環(huán)境、品種、病害的影響會產(chǎn)生很大波動。為解決該問題，該研究團隊前期建立了木豆毛狀根培養(yǎng)物（PPHRCs）作為穩(wěn)定生產(chǎn)CSA的可持續(xù)替代來源。為使該方法能夠實現(xiàn)高效益的生產(chǎn)價值，該研究團隊在本文中探索了一種有前景的方法來提高PPHRCs中CSA的積累，以滿足營養(yǎng)保健/制藥行業(yè)對CSA的需求。

二、研究方法

該文章研究團隊在前期獲取了高CSA產(chǎn)量的木豆毛狀根，將其接種于特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)42天獲得PPHRCs。將健康木豆葉片中分離的一株內生真菌（P. rubens）培養(yǎng)至菌絲狀態(tài)，收集菌絲。收集到的菌絲一部分用于超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術（UPLC-MS/MS）檢測CSA產(chǎn)量，一部分用于與PPHRCs共培養(yǎng)，觀察菌絲與毛狀根相互作用過程與CSA產(chǎn)量變化。

三、結果

圖1 共培養(yǎng)過程與CSA產(chǎn)量檢測

圖A為P. rubens真菌與PPHRCs系統(tǒng)共培養(yǎng)示意圖；圖B為共培養(yǎng)體系表型及共培養(yǎng)體系CSA產(chǎn)量變化

為確定P. rubens不同接種量對PPHRCs的CSA生物合成是否有影響，采用不同接種量進行共培養(yǎng)，結果表明，P. rubens促進PPHRCs的中CSA的生物合成和積累的能力不受劑量效應的影響，以接種劑量為0.5%g/mL最有利于實現(xiàn)CSA高產(chǎn)。

圖2 不同P. rubens接種量的培養(yǎng)基顏色變化與CSA產(chǎn)量統(tǒng)計

圖A為不同P. rubens接種量的培養(yǎng)體系表型，圖B-E為對應不同接種量的同培養(yǎng)條件下的CSA產(chǎn)量統(tǒng)計

由于在上述共培養(yǎng)過程中觀察到了典型的防御反應，推測P. rubens在定殖早期引起了毛狀根的短暫免疫反應，因此采用顯微觀察、掃描電鏡、棉酚藍染色以及免疫細胞化學染色觀察P. rubens菌絲在木豆毛狀根上的定殖過程。結果顯示，毛狀根的顏色從黃色變?yōu)樽厣砻婵梢娯S富的菌絲（圖3B紅色箭頭）；在掃描電鏡下（圖3CD），P. rubens菌絲附著在毛狀根表面，形成明顯的附著胞狀結構，且表面出現(xiàn)輕微破裂（圖3D）。

圖3 P. rubens與PPHRCs的顯微觀察

圖AB為42天毛狀根單獨培養(yǎng)與共培養(yǎng)96 h后的圖像；圖CD為前述條件下的掃描電鏡圖片（放大1000倍）；圖EF為棉酚藍染料染色后毛狀根單獨與共培養(yǎng)體系的顯微圖片（放大400倍）

在棉酚藍染料染色后（圖3EF）在36 h時觀察到大量菌絲；取36 h時的共培養(yǎng)樣品進行免疫細胞化學染色（圖4），綠色為ConA-FITC染色，藍色為DAPI染色，紅色箭頭所指位置為菌絲的分布位置，主要分布在毛狀根的細胞間隙或者細胞壁表面，該結果表明共培養(yǎng)的情況下，P. rubens菌絲可以滲透到毛狀根組織中，形成穩(wěn)定的共生關系。

圖4 免疫細胞化學染色后毛狀根與P. rubens的共定位結果

圖A-C為毛狀根單獨培養(yǎng)的共定位結果，圖D-F為毛狀根與P. rubens共培養(yǎng)后的共定位結果；紅色箭頭位置位于毛狀根的細胞間隙

四、結論

本文通過將木豆毛狀根培養(yǎng)物與內生真菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)的早期階段，P. rubens的加入促進了木豆毛狀根的CSA生成與積累，并在36 h后CSA產(chǎn)量出現(xiàn)了顯著下降，可能是由于建立穩(wěn)定共生關系導致了毛狀根組織中CSA分泌的減少，免疫細胞化學染色結果證實了該穩(wěn)定共生關系的存在。

五、辰英價值

本研究中采用的S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)采用了三條紋轉盤共聚焦成像技術，配合電動Z軸快速移動掃描，進行有一定厚度的植物根部橫切斷面快速三維掃描，滿足了有一定高度起伏的樣品，同時看清多個焦面的需求。得益于S3000超快三維熒光成像系統(tǒng)高達95%QE的面探測器，既提高了成像的靈敏度，也加快了成像速度，為P. rubens和木豆毛狀根的相互作用提供了有效的觀測工具。

六、研究團隊

東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院專任教師，主要從事藥用植物生物技術、藥用植物活性成分生物合成代謝調控及生物轉化、藥用植物活性成分高值化利用等研究，建立了系列藥/食用植物體外細胞/組織/器官及內生真菌培養(yǎng)體系，并利用該生物體系闡明了多種重要功能森林活性成分的次生代謝調控機制，為我國森林植物資源活性成分研究的深層次發(fā)展提供了科學思路和積極示范。

東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院專任教師，主要從事藥用植物生物技術及次生代謝活性產(chǎn)物生物合成調控機制研究，包括藥用植物毛狀根培養(yǎng)技術、藥用植物細胞懸浮培養(yǎng)技術及次生代謝產(chǎn)物生物合成關鍵調控酶基因篩選等內容。