2024年12月26日，中國科學(xué)院長春光機(jī)所李備研究員與牛津大學(xué)黃巍教授、中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所馮世倫研究員在《SENSORS AND ACTUATORS B-CHEMICAL》上合作發(fā)表題為“Functionalized microwell laser sorting method for single-cell viable microbial detection”的文章，第一作者為王云桐博士。文中提出了一種功能化微孔激光分選平臺(tái)用于單個(gè)微生物細(xì)胞活體研究。開發(fā)的新型微陣列分選芯片結(jié)合基于激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移（LIFT）技術(shù)，在長光辰英核心產(chǎn)品——PRECI SCS-R300拉曼單細(xì)胞分選儀上，實(shí)現(xiàn)液體環(huán)境中活性單細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)與分選培養(yǎng)，對(duì)大腸桿菌、釀酒酵母等微生物的單細(xì)胞培養(yǎng)成活率達(dá)到95%以上。

自然界中大部分微生物尚未獲得純培養(yǎng)，單細(xì)胞技術(shù)在微生物生態(tài)研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，由于微生物樣品復(fù)雜、雜質(zhì)多，細(xì)胞形態(tài)差異大、易彼此粘黏，目標(biāo)菌豐度低等問題，傳統(tǒng)單細(xì)胞檢測(cè)與分離技術(shù)（如流式細(xì)胞術(shù)等）對(duì)微生物樣品的適用性不強(qiáng)。而基于激光誘導(dǎo)正向轉(zhuǎn)移(LIFT)原理的單細(xì)胞分選技術(shù)，由于分選精度高、雜質(zhì)兼容性強(qiáng)、可視化等特點(diǎn)，在很大程度上解決了上述問題。該技術(shù)與共聚焦拉曼光譜技術(shù)的結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜微生物樣品中功能菌的有效識(shí)別與篩分，極大提高了功能菌篩選與研究效率。為進(jìn)一步提升LIFT分選技術(shù)的適用性，本研究將微陣列分選芯片與 LIFT技術(shù)結(jié)合，開發(fā)了一種用于液體中單個(gè)微生物細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)及自動(dòng)分選的平臺(tái)（功能化微孔激光分選平臺(tái)，F(xiàn)MLS），為微生物單細(xì)胞研究提供了新型有力工具。

本研究設(shè)計(jì)并制作了一款新型功能化微陣列分選芯片，并與PRECI SCS-R300拉曼單細(xì)胞分選儀組成了功能化微孔激光分選平臺(tái)（FMLS），實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的拉曼光譜檢測(cè)與精準(zhǔn)分離。其中，微陣列分選芯片上設(shè)計(jì)集成了數(shù)十萬個(gè)微陣列小室，用于捕獲液體中的微生物單細(xì)胞，并統(tǒng)計(jì)了微孔對(duì)單細(xì)胞的捕獲效率。隨后，為驗(yàn)證該芯片在分選過程中對(duì)小室中的細(xì)胞無高溫?fù)p傷，進(jìn)行了分選過程的溫度模擬。同時(shí)，本文采用了多種微生物（包括大腸桿菌、釀酒酵母、膠紅酵母等）對(duì)FMLS系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，確定其拉曼光譜檢測(cè)與分選能力，以及維持高細(xì)胞活性和保留基因組信息的能力。

圖1 FMLS系統(tǒng)對(duì)單細(xì)胞鑒定分離培養(yǎng)流程

1. 微孔彈射芯片的設(shè)計(jì)

本研究設(shè)計(jì)的微陣列芯片上集成了70萬個(gè)微孔，孔徑可根據(jù)分選細(xì)胞的大小進(jìn)行定制。分選過程的溫度模擬展示了微孔中的溫度分布（圖2 a）。結(jié)果顯示，隨著與激光點(diǎn)距離的增加，液體溫度呈現(xiàn)驟降。在短暫的激光脈沖暴露期間，高溫被限制在極小的范圍內(nèi)，周圍液體溫度保持在 30 °C 以下。當(dāng)微孔芯片翻轉(zhuǎn)時(shí)，細(xì)胞在重力作用下遠(yuǎn)離激光焦點(diǎn)（圖2 b），微生物細(xì)胞保持在安全溫度范圍內(nèi)，并且在分選過程中不受溫度擴(kuò)散的影響，確保了微生物分選過程的可行性。

圖2 微陣列分選過程的溫度分布模型和單個(gè)細(xì)胞的共聚焦 3D 圖像

圖a為微孔內(nèi)溫度變化、激光作用的垂直距離和持續(xù)時(shí)間之間相關(guān)性的 3D 表面映射；圖b為微孔中捕獲的單個(gè)微生物細(xì)胞的共聚焦3D圖像（橫截面），上邊界代表芯片表面

2. 微陣列芯片的單細(xì)胞捕獲率

采用熒光標(biāo)記釀酒酵母來統(tǒng)計(jì)微陣列芯片的單細(xì)胞捕獲率，結(jié)果如圖3所示，在普通芯片上釀酒酵母會(huì)遷移呈環(huán)狀（圖3 a），在環(huán)狀邊緣部分聚集（圖3 b）。而在微陣列芯片上，不同濃度的釀酒酵母均勻分散在微陣列中（圖3 c-e）。在5×10⁷ cells/mL樣品濃度下，統(tǒng)計(jì)不同尺寸微生物的捕獲率，結(jié)果顯示，直徑為1 μm左右的大腸桿菌和5 μm的酵母分別能夠達(dá)到90.32%和90.64%；直徑為3 μm左右的藍(lán)藻單細(xì)胞捕獲率可達(dá)82.55%，直徑為10 μm左右的衣藻可達(dá)81.98%。總體而言，微陣列芯片的單細(xì)胞捕獲率普遍能達(dá)到80%以上。

圖3 微生物單細(xì)胞捕獲性能評(píng)估

圖a 熒光標(biāo)記的釀酒酵母在普通芯片上的環(huán)狀成像效果；圖b為a中環(huán)上的釀酒酵母放大效果；圖c-e分別為10⁷ ，5×10⁷, 10⁸ cells/mL濃度下微陣列芯片上的單細(xì)胞捕獲效果；圖f為不同濃度下單細(xì)胞捕獲率的統(tǒng)計(jì)；圖g為不同尺寸的微生物在不同孔徑的微陣列芯片上的平均捕獲率統(tǒng)計(jì)；圖h為微陣列芯片倒置時(shí)的明場(chǎng)顯微成像

3. 微生物單細(xì)胞的拉曼光譜檢測(cè)與分選

進(jìn)一步采用PRECI SCS-R300拉曼單細(xì)胞分選儀識(shí)別并分離培養(yǎng)了釀酒酵母（S. cerevisiae）和類胡蘿卜素標(biāo)記的膠紅酵母（R. mucilaginosa）這2種形態(tài)相似的微生物。基于類胡蘿卜素特征峰識(shí)別膠紅酵母單細(xì)胞（圖4 b）。通過對(duì)蓋玻片上接收到細(xì)胞的顯微成像評(píng)估分選效果。如圖4所示，相鄰微孔中的細(xì)胞分選后，在蓋玻片上可以觀察到與微孔排列相近的細(xì)胞位置排列，體現(xiàn)了FMLS平臺(tái)精準(zhǔn)可靠的分離效果。此外，采用不同的激光能量對(duì)不同微生物單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示在激光能量達(dá)到一定閾值（120 nJ）后，分選效率近乎達(dá)到100%（圖4 j）。

圖4 液體環(huán)境下單細(xì)胞的鑒定與分離

圖a為兩種酵母細(xì)胞的單細(xì)胞特征光譜均譜，有色區(qū)域表示單細(xì)胞測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)差；圖b為混合樣品中分類后的膠紅酵母的拉曼光譜；圖c為常規(guī)LIFT液體分選的動(dòng)態(tài)過程圖像；圖d為三個(gè)相鄰微孔中單細(xì)胞捕獲的顯微照片；圖e-g為依次分離三個(gè)微孔中單個(gè)微生物的分選過程；圖h為空白蓋玻片的顯微成像；圖i為三個(gè)分離單細(xì)胞的精準(zhǔn)接收；圖j為不同激光能量下不同微生物單細(xì)胞的分選效率

4. 單細(xì)胞培養(yǎng)存活率與基因組覆蓋率評(píng)估

為證實(shí)FMLS系統(tǒng)的低損傷性，分別對(duì)大腸桿菌和釀酒酵母進(jìn)行單細(xì)胞分選培養(yǎng)。結(jié)果表明，大腸桿菌和釀酒酵母的單細(xì)胞分選存活率分別約為97.2%和95.8%（圖5 a,b）。另外，對(duì)培養(yǎng)的大腸桿菌和釀酒酵母分別進(jìn)行了16S rRNA序列驗(yàn)證，證實(shí)了物種信息（圖5 c,d），并進(jìn)一步對(duì)分離得到的大腸桿菌單細(xì)胞進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增與單細(xì)胞重測(cè)序，其單細(xì)胞基因組覆蓋度達(dá)到88%，進(jìn)一步證實(shí)了FMLS平臺(tái)在微生物單細(xì)胞培養(yǎng)及測(cè)序方面的應(yīng)用價(jià)值。

圖5 細(xì)胞活力分析和分離單細(xì)胞物種鑒定

圖a為大腸桿菌和釀酒酵母單細(xì)胞分選后孵育36小時(shí)的照片；圖b為分選單細(xì)胞孵育36小時(shí)后的存活率統(tǒng)計(jì)；圖c為分選培養(yǎng)的大腸桿菌單細(xì)胞菌落(D1-D8)凝膠電泳圖，CD為細(xì)胞懸液對(duì)照；圖d為分選培養(yǎng)的釀酒酵母單細(xì)胞菌落16S rRNA凝膠電泳圖

本文開發(fā)了一種結(jié)合微陣列芯片與PRECI SCS-R300拉曼單細(xì)胞分選儀的新型功能化微孔激光分選平臺(tái)（FMLS），實(shí)現(xiàn)了液體中活體微生物單細(xì)胞的高效、準(zhǔn)確捕獲、拉曼光譜檢測(cè)與可視化精準(zhǔn)分選。FMLS系統(tǒng)在捕獲效率、檢測(cè)特異性、細(xì)胞活性保持及基因組覆蓋率等方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，為微生物學(xué)提供了一種極具價(jià)值的單細(xì)胞研究工具。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.137202

在本研究中，微陣列芯片與長光辰英的PRECI SCS-R300拉曼單細(xì)胞分選儀聯(lián)合組成了功能化微孔激光分選平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)液體環(huán)境中不同種類、尺寸的活體微生物單細(xì)胞的無損、精準(zhǔn)分離。由于LIFT分選技術(shù)具有雜質(zhì)兼容性高、樣品適用性強(qiáng)、分選準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)，有效解決了當(dāng)前微生物單細(xì)胞檢測(cè)與分離的技術(shù)難題，在環(huán)境及生物醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義。

本文中研制的微陣列芯片已由長光辰英成功轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品——HoneyArray微陣列分選培養(yǎng)芯片，該芯片具有保水及蜂巢狀微陣列設(shè)計(jì)，點(diǎn)樣后微生物單細(xì)胞會(huì)進(jìn)入微陣列的各孔內(nèi)，此時(shí)可應(yīng)用PRECI SCS系列產(chǎn)品進(jìn)行單細(xì)胞顯微成像、拉曼光譜檢測(cè)與活體分離，分選得到的細(xì)胞可進(jìn)行培養(yǎng)及測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)。

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X-Lab介紹

X-Lab是中國科學(xué)院長春光機(jī)所李備研究員帶領(lǐng)的科研創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，與牛津大學(xué)、格拉斯哥大學(xué)、卡迪夫大學(xué)等國際頂尖光學(xué)及微流控等領(lǐng)域科學(xué)家合作，專注于細(xì)胞操縱、拉曼光譜、共聚焦成像、微流控和人工智能五大核心領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)室目前擁有近20位碩博士科研團(tuán)隊(duì)，發(fā)表SCI論文20余篇，承擔(dān)國家及省部級(jí)研發(fā)項(xiàng)目10余項(xiàng)，展現(xiàn)出強(qiáng)大的研發(fā)和創(chuàng)新能力。X-Lab作為長光辰英的前沿技術(shù)探索與儲(chǔ)備力量，將持續(xù)推出創(chuàng)新科研成果。

黃巍教授介紹

牛津大學(xué)生物工程學(xué)教授。牛津大學(xué)圣埃德蒙學(xué)院Fellow。在國際優(yōu)秀學(xué)術(shù)期刊發(fā)表SCI論文160余篇，包括《Nature》和《Science》系列子刊如Nature Microbiology, Nature Communications, Science Advances, PNAS, ISME Journal, British Journal of Cancer等，并多次榮獲國際大獎(jiǎng)。目前擔(dān)任國際期刊Environmental Microbiology和Microbial Biotechnology的編輯。主要研究領(lǐng)域是微生物分子生物學(xué)和單細(xì)胞生物學(xué)。率先提出并發(fā)展了包括拉曼光鑷分選，拉曼彈射分選，拉曼微流控分選，拉曼-熒光探針和拉曼-同位素探針等多項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)。此外，黃教授在生物傳感器技術(shù)的開拓中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是超聲波核酸轉(zhuǎn)移細(xì)胞技術(shù)的發(fā)明者。截至目前，擁有60余項(xiàng)專利，多項(xiàng)發(fā)明成果成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

馮世倫研究員介紹

馮世倫博士，碩士畢業(yè)于挪威東南大學(xué)，博士畢業(yè)于澳大利亞麥考瑞大學(xué)，于新加坡南洋理工大學(xué)從事博士后研究，現(xiàn)任中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所傳感技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室集成光電生化傳感器負(fù)責(zé)人/副研究員、上海市體外診斷芯片技術(shù)創(chuàng)新中心生物微流控芯片首席科學(xué)家等，同時(shí)擔(dān)任中國微米納米協(xié)會(huì)生物微機(jī)電理事、中國轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)聯(lián)盟暨中國精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)理事；曾獲上海市海外領(lǐng)軍人才（青年）、上海市浦江人才等榮譽(yù)。先后主持項(xiàng)目/課題8項(xiàng)；擔(dān)任SCI期刊 Micromachines 編委，Chinese Chemical Letters、View、BMemat等青年編委。發(fā)表高質(zhì)量SCI論文80余篇，引用約2000次；授權(quán)發(fā)明專利6項(xiàng)；主要攻關(guān)于病原體相關(guān)生物微流控芯片以及便攜式即時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)（POCT）系統(tǒng)整機(jī)研制，多款整機(jī)裝備已經(jīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化應(yīng)用。