2024年11月1日，中國科學院長春光機所李備研究員X-lab團隊與格拉斯哥大學徐嘉寶博士在《Talanta》上合作發表題為“Microwell-Assembled Aluminum Substrates for Enhanced Single-Cell Analysis: A Novel Approach for Cancer Cell Profiling by Raman Spectroscopy”的文章，第一作者為X-Lab王云桐博士。文中開發了一種新型拉曼光譜檢測芯片，可用于液體環境中單細胞的拉曼光譜檢測，成功實現了肺癌細胞與正常細胞的拉曼分類模型構建。長光辰英核心產品——P300共聚焦拉曼光譜儀為本文中單細胞拉曼檢測提供了高穩定性、高精度的檢測平臺。

近年來，隨著對細胞群體內在異質性認識的深入，單細胞水平的研究受到廣泛關注。傳統技術如流式細胞術、單細胞測序和質譜分析等，在推進單細胞分析研究中發揮了重要作用，但也存在空間分辨率低、破壞細胞完整性和生物信息提取速度慢等局限。自發拉曼光譜作為一種無創、無標記、快速準確的檢測手段，在生物領域的應用日益增多，能夠精確“快照”單細胞的化學成分和代謝狀態。然而，由于細胞貼壁培養和干燥收縮的特性，目前的單細胞拉曼光譜檢測難以在液體環境中對非固定細胞進行精準測量。本文介紹了一種新型微孔組裝金屬基板芯片，實現了無標記、無創、精準的活性單細胞拉曼檢測，并利用該芯片和拉曼光譜平臺實現了癌細胞與正常細胞間的區分。

本文設計了一款新型微孔組裝金屬基板芯片。該芯片利用金屬基板增強了液體中的自發拉曼信號強度，提高了信噪比 （SNR）；利用微孔防止了細胞堆積，確保準確捕獲拉曼信號。十余萬個微孔陣列有助于實現高通量細胞檢測，并為液體中懸浮細胞的拉曼測量提供穩定條件。依次進行細胞培養、重懸、清洗，點樣至芯片上，對PC-9肺癌細胞和BEAS-2B正常支氣管上皮細胞進行拉曼光譜的采集，以驗證芯片的適用性。此外，本研究還運用機器學習分類模型對兩種細胞進行分類，以評估新型芯片結合拉曼檢測的精度和穩定性。

本文中的微孔芯片經過精確設計，可匹配靶細胞大小，確保每個微孔只容納一個細胞（圖1），通過等離子體處理組裝了金屬涂層的基材和微孔。該設計有助于更有效地捕獲單細胞，并能夠準確、穩定地采集單細胞拉曼光譜，這對于詳細的單細胞分析至關重要。

將普通金屬基板與新型微孔金屬基板進行比較，滴加同樣的液滴后，普通金屬基板的液滴擴散不均勻，且細胞垂直堆積嚴重（圖2a, b）。在普通基板上檢測拉曼的過程中，受到液體表面張力的影響，導致細胞在1s內離開激光檢測位置（圖2c, d），嚴重影響單細胞拉曼檢測采集的穩定性。

相比之下，新型微孔金屬基板在滴加液滴后，由于微孔聚對二甲苯材料的疏水性以及微孔的高縱橫比，有效降低了表面張力并破壞了流體界面處的橫向剪切力，最大限度地降低了細胞垂直堆積。另外，微孔的存在使得細胞在液體環境中被高效捕獲并固定（圖2e），極大減少了細胞的運動，為單細胞拉曼信號的采集提供了更高的穩定性和準確性。

將PC-9細胞分別加樣在金屬基底微孔板和玻璃底微孔板上，在5mW，3s的拉曼檢測條件下，對該細胞指紋區的平均光譜和光譜信噪比進行了統計。結果發現，金屬基底微孔板較普通玻璃底微孔板的光譜信號強度更強（圖3a, b），光譜間的標準差更?。▓D3c），平均信噪比顯著提高了70.34％（圖3d）。上述結果表明，金屬基底微孔板上的細胞能夠產生更高的信噪比和更穩定的拉曼信號，而新型微孔組裝金屬基板芯片上結合了十幾萬微孔小室與金屬基底穩定增強拉曼信號，預計能夠實現高通量單細胞拉曼檢測。

圖3微孔金屬基板與微孔玻璃基板對拉曼信號采集的影響

圖a為金屬基板上單細胞平均拉曼光譜；圖b為玻璃基板上單細胞平均拉曼光譜（灰色部分為拉曼光譜標準差）；圖c為兩種基板上拉曼光譜信噪比統計；圖d為兩種基板上單細胞拉曼光譜信噪比豐度統計

采用新型微孔組裝金屬基板芯片采集肺癌細胞PC-9和正常支氣管上皮細胞BEAS-2B的拉曼光譜（圖4a），銜接t-SNE算法對光譜數據進行降維可視化，結果顯示兩種細胞的拉曼光譜呈現兩個不同的單細胞簇，分別代表兩種細胞類型（圖4b）。

圖4 腫瘤細胞與正常細胞拉曼光譜采集與無監督聚類

圖a為基于新型芯片與共聚焦拉曼光譜儀平臺對兩種細胞采集的平均拉曼光譜；圖b為兩種細胞拉曼光譜t-SNE無監督聚類的可視化結果

為了進一步提升所述分類平臺的性能，本研究采用了監督式機器學習算法，包括k近鄰（kNN）和極端梯度提升（XGBoost），以構建高效的分類模型。通過將兩種細胞的拉曼光譜數據按照4:1的比例劃分為訓練集和測試集，并運用三重交叉驗證方法來評估模型的可靠性，確保了模型評估的嚴謹性和準確性。實驗結果表明，kNN模型的分類準確度達到了97.8%（圖5ab），而XGBoost模型的分類準確度更是達到了完美的100%（圖5cd）。這兩種分類模型的高識別精度一致性地證實了微孔組裝金屬基板芯片在提升單細胞拉曼信號質量和識別率方面的顯著效果。結合這些先進的監督式機器學習算法，該平臺在臨床診斷和精準醫療領域展現出巨大的應用潛力，有望實現對單細胞層面的精確分析和診斷。

圖5 監督式機器學習算法對腫瘤細胞和正常細胞的分類

圖ab分別為kNN算法測試集的混淆矩陣與可靠性驗證的ROC曲線；圖cd分別為XGBoost算法測試集的混淆矩陣與可靠性驗證的ROC曲線

本文介紹了一種創新的微孔組裝金屬基板芯片，該芯片在單細胞領域展現出顯著效果，有效避免了細胞在液體環境中的堆疊現象，并成功實現了液體環境下的單細胞拉曼光譜檢測。通過對比癌細胞PC-9與正常細胞BEAS-2B的單細胞拉曼光譜，驗證了該芯片與拉曼光譜儀結合平臺在細胞成分分析和腫瘤細胞分類上的應用潛力與可靠性。這一成果為生物醫學領域，尤其是在癌癥研究和藥物開發等關鍵領域，提供了一種新的、可靠的單細胞拉曼分析手段。

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