《Journal of Biophotonics》丨基于無標記熒光壽命成像技術分選年輕的釀酒酵母單細胞

2022.02.18

2022年1月3日，復旦大學馬炯教授團隊應用辰英核心產品——PRECI SCS單細胞分選儀在《Journal of Biophotonics》雜志上發表了題為“Single Cell Sorting of Young Yeast Based onLabel-free Fluorescence Lifetime Imaging Microscop”的論文，基于無標記熒光壽命成像結合單細胞分選技術在單細胞水平上分選年輕有活力的酵母細胞，在發酵工業具有較大的應用價值。

一、研究背景

酵母在工業發酵過程中被重復利用，但是酵母生長過程中存在明顯的異質性。在發酵過程中，高活性的酵母細胞在隨后的發酵過程中至關重要。隨著細胞的衰老，代謝活動的減少是影響酵母功能的重要因素。因此,一個精準區分衰老釀酒酵母和年輕酵母的方法是必要的。為了研究年輕酵母的識別分選方法，作者使用熒光壽命成像（FLIM）和激光誘導正向轉移(LIFT)技術，在細胞原位狀態下，通過無標記的熒光壽命成像技術高精度識別、激光誘導正向轉移技術分選年輕的酵母細胞。本研究發現NAD(P)H可以作為FLIM檢測的生物標志物，用于準確區分酵母細胞的代謝狀態，進而判斷酵母年輕或衰老。這種無標記熒光成像原位分選方法為釀酒酵母在工業和研究中的許多應用提供了一個新的途徑。

摘要圖

二、研究成果

1. 釀酒酵母的生長曲線和芽痕：研究中發現不同酵母細胞表面同時存在不同數量的芽痕。少于兩個芽痕的酵母細胞數基本保持不變，這與之前的報告結果一致。在酵母生長曲線研究中，圖2A所示的結果表明酵母生長20小時，然后酵母生長達到對數期，酵母數量基本保持不變。酵母芽痕染色如圖2B所示，酵母細胞的芽痕從0到6個不等，表明酵母在同一時間點有很強的異質性。在不同的培養時間，每個時間點至少計數600個酵母細胞的芽痕。如圖2C所示，酵母細胞出芽率由6 h的9.3%±1.4%逐漸下降至48小時的0.4%±0.4%。在基本條件保持不變連續培養的情況下，少于兩個芽痕的酵母細胞數約占總酵母細胞的65%-70%。此外，還發現有2 ~ 4個芽痕的酵母細胞在6 ~ 36 h無顯著性差異(15%~20%)，但是在48h微降至 13.4% ± 1.4%。有4個以上芽痕的酵母從6 h 的5.0% ±1.2% 到12 h 的8.3% ± 1.7%, 在連續培養下，24h達到了13.2% ± 1.0%，36 h 17.4% ± 5.0%。36h (17.4%±5.0%)和48h的(15.1%±1.1%)無顯著差異。結果表明，將酵母細胞在一個培養基中培養時，酵母的年齡分布有明顯的異質性。

圖2 酵母的生長曲線及不同生長時間的含有不同芽痕數目的酵母比例

2.酵母細胞NAD(P)H的熒光成像：通過NAD(P)H熒光壽命研究酵母細胞的代謝狀態的手段包括平均壽命 (tm)，結合蛋白的NAD(P)H的占比 (a2)，游離的NAD(P)H的壽命(t1)，以及結合蛋白的NAD(P)H 的壽命(t2)。酵母6h至 48h tm 和a2 的熒光壽命圖像如圖3A所示。綠色代表酵母細胞的 tm在0.2–0.6ns，紅色代表tm在0.6–1.5ns。局部放大的圖像中顯示的是在12h一個典型的正在出芽的細胞，母細胞的tm和 a2分別為0.51ns和21.38%，而子細胞的tm和a2較小，分別為0.32 ns 和16.72%。tm和a2的分布曲線如圖3B所示，每個曲線由150-200個酵母細胞的加和得出。tm的峰值從6h的0.36ns 增加到48h的0.58ns。a2 的峰值從6h的10.40%增加到48h的21.98%。圖3C中顯示的統計數據分析并平均了每個時間點的150到200個酵母細胞。發現酵母在6h的tm為 0.36±0.09ns，這與48h的0.58 ±0.11ns 顯著不同，但與12h的0.37 ±0.03ns，24h的0.36±0.05ns，36h的0.51±0.10ns 沒有明顯差異。此外，6h的a2為10.40%±0.58%，與24h的16.40% ±1.34%，36h的 18.80%±1.63%，尤其是48 h的21.98%±2.56%有顯著差異，與12h的11.15% ±0.50%無顯著性差異。此外，tm由三個獨立的參數，t1，t2 和a2決定的。基于我們的FLIM數據（圖3和圖S1），選擇a2作為區分年輕細胞的獨立參數，因為老化酵母的a2大于年輕的酵母。同時，從 6 到36ht1和t2無顯著差異。酵母24h的a2平均值為16.40%，24h的酵母細胞處于對數生長狀態。因此，將16%的a2值作為區分酵母細胞是否年輕的標準。

圖3 酵母6 h – 48 h熒光壽命成像及統計分析結果

3. 酵母單細胞分選：通過 LIFT 系統分選年輕的酵母細胞，隨后在培養箱中培養。分選流程圖和分選芯片示意圖如圖4A和4B所示。圖4C 顯示了三個原位酵母細胞分選前后的FLIM顯微圖像。如圖4C所示，一個a2較大的酵母細胞（紅色箭頭，18.3%）和具有較小 a2的2個酵母細胞（綠色箭頭，13.4% 和 14.8%）可以通過 FLIM 區分識別。然后，利用LIFT系統分別將三個酵母細胞分選到單獨的培養皿中。2個a2較小的酵母細胞在培養24h后形成單克隆菌落（圖4D），而a2（18.3%）較大的酵母未形成單克隆菌落。對照組結果顯示，95%的酵母細胞分選后存活并形成單克隆菌落。

然而，結合蛋白的NAD(P)H（a2）值小于16%的酵母細胞，即年輕活躍的細胞，分選結果顯示有84± 3% 的細胞可以形成一個菌落（圖 4E）。進而可以推測，由FLIM的激發激光帶來的損傷約占11%。將來如果熒光信號變得更高或熒光檢測系統更加敏感，光損傷可以進一步減少。

圖4 分選原理及分選芯片示意圖及熒光壽命結合

三、結論

本研究展示了一種在單細胞水平上，基于細胞代謝和使用 FLIM 和 LIFT結合的方法分選年輕酵母細胞的分選系統。酵母老化過程中的代謝變化，包括結合蛋白的NAD(P)H占比數值 (a2) 和 NAD(P)H平均熒光壽命 (tm)的增加。因此，將NAD(P)H作為FLIM檢測的生物標志物，可用于準確區分年輕和老化的酵母細胞。當酵母細胞保持在無菌和潮濕的環境中，通過低分選能量的LIFT 系統，可將年輕的高活性酵母細胞一一分選到培養基中并重新培養至形成獨立的單克隆菌落。作為一種廣泛使用的工業模型和疾病研究的微生物，釀酒酵母在市場和研究中具有較強的吸引力。這種無標記原位分選方法為釀酒酵母在工業和研究中的許多應用提供了一個新的方法，在發酵工業具有重要應用價值。

文獻鏈接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34978383/

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